一、3D腫瘤球體的培養(yǎng)流程 

1. 培養(yǎng)系統(tǒng)的選擇

- 旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器（RWV） 

  - 通過持續(xù)旋轉(zhuǎn)（速度通常為15-30 rpm）使細胞處于自由懸浮狀態(tài)，減少剪切力損傷，促進細胞自聚集形成球體。 

  - 優(yōu)勢：適用于大規(guī)模培養(yǎng)，能生成均一性較好的球體。 

  - 案例：NASA的旋轉(zhuǎn)壁容器常用于培養(yǎng)乳腺癌、膠質(zhì)瘤等腫瘤球體。 

- 懸滴法（Hanging Drop） 

l  將細胞懸液滴加在培養(yǎng)板蓋背面，利用重力作用使細胞在液滴底部聚集形成球體。 

l  優(yōu)勢：操作簡單，適合高通量藥物篩選。 

l  局限：球體尺寸較?。ㄍǔ?span><500 μm），難以長期維持。 

- 磁懸浮3D培養(yǎng)（如BioLevitator） 

l  利用納米磁性顆粒標記細胞，通過磁場抵消重力，形成無支架3D球體。 

l  優(yōu)勢：快速成球（24-48小時），可精準控制球體大小。 

- 基質(zhì)膠（Matrigel）或水凝膠支持法

l  將腫瘤細胞嵌入富含ECM成分的基質(zhì)膠中，模擬體內(nèi)基質(zhì)支撐。 

l  優(yōu)勢：保留細胞-基質(zhì)相互作用，適用于侵襲性研究。 

2. 關(guān)鍵步驟與技術(shù)參數(shù)

1.細胞選擇與預(yù)處理 

l  使用患者來源的原代腫瘤細胞（PDCs）或腫瘤細胞系（如MCF-7、U87-MG）。 

l  添加腫瘤相關(guān)成纖維細胞（CAFs）、免疫細胞（如T細胞、巨噬細胞）共培養(yǎng)，模擬TME的異質(zhì)性。 

2. 培養(yǎng)條件優(yōu)化 

l  細胞密度：通常為5×103~1×10? cells/mL（過高易形成壞死核心）。 

l  培養(yǎng)基：添加生長因子（如EGF、bFGF）、低血清（2-5% FBS）以抑制單層貼壁生長。 

l  氧濃度：通過低氧培養(yǎng)箱（1-5% O?）模擬腫瘤內(nèi)部缺氧環(huán)境，激活HIF-1α通路。 

3. 動態(tài)監(jiān)測與質(zhì)量控制 

l  球體尺寸：通過顯微鏡或自動成像系統(tǒng)監(jiān)測（目標直徑：200-1000 μm）。 

l  活性檢測：Calcein-AM（活細胞綠色熒光）/碘化丙啶（PI，死細胞紅色熒光）雙染色。 

l  代謝分析：檢測乳酸分泌、葡萄糖消耗評估代謝重編程（Warburg效應(yīng)）。 

二、模擬腫瘤微環(huán)境的關(guān)鍵策略

1. 細胞異質(zhì)性共培養(yǎng)

l  腫瘤細胞 + 基質(zhì)細胞：共培養(yǎng)CAFs、內(nèi)皮細胞（模擬血管生成）或間充質(zhì)干細胞（MSCs）。 

l  免疫細胞浸潤模型：加入T細胞、巨噬細胞（如THP-1來源的M2型），研究免疫逃逸機制。 

2. 細胞外基質(zhì)（ECM）的調(diào)控** 

l  基質(zhì)成分：添加膠原蛋白（Ⅰ/Ⅳ型）、纖連蛋白、透明質(zhì)酸，模擬腫瘤ECM的剛性（5-20 kPa）。 

l  動態(tài)ECM重塑：利用酶（如MMP-2/9）或機械刺激模擬腫瘤侵襲過程中的基質(zhì)降解。 

3. 梯度氧與營養(yǎng)供應(yīng) 

l  -氧梯度：通過微流控芯片（Organ-on-a-chip）在球體中建立氧濃度梯度，模擬核心缺氧與邊緣富氧區(qū)域。 

l  -藥物滲透測試：將阿霉素等化療藥加入系統(tǒng)，觀察球體內(nèi)部藥物分布差異（與外層相比，核心藥物濃度可能降低10倍以上）。 

三、3D腫瘤球體的應(yīng)用場景 

1. 腫瘤生物學研究 

l  侵襲與轉(zhuǎn)移：通過Transwell實驗或活細胞成像，觀察球體細胞向周圍基質(zhì)的遷移能力。 

l  耐藥性機制：比較2D與3D培養(yǎng)中腫瘤細胞對順鉑、紫杉醇的IC50差異（3D模型通常耐藥性高10-100倍）。 

2. 個性化藥物篩選

l  患者來源腫瘤球體（PDOs）：將手術(shù)樣本直接培養(yǎng)為球體，測試個體化化療方案（敏感性預(yù)測準確率>80%）。 

l  免疫治療評估：將PD-1/PD-L1抑制劑與腫瘤球體+免疫細胞共培養(yǎng)，檢測T細胞殺傷效率。 

3. 腫瘤-微環(huán)境互作研究

l  血管生成實驗：在球體中嵌入內(nèi)皮細胞，觀察微血管網(wǎng)絡(luò)的形成（VEGF抑制劑可顯著抑制此過程）。 

l  代謝交互作用：通過代謝組學分析腫瘤細胞與CAFs之間的乳酸-谷氨酰胺交換。 

四、技術(shù)挑戰(zhàn)與優(yōu)化方向 

1. 標準化問題 

l  不同實驗室的球體尺寸、細胞比例差異較大，需建立統(tǒng)一評價標準（如MINAST準則）。 

2. 血管化與長期培養(yǎng)

l  現(xiàn)有球體內(nèi)部易壞死（>500 μm時），需結(jié)合生物打印技術(shù)構(gòu)建血管化通道。 

3. 高內(nèi)涵分析技術(shù) 

l  開發(fā)AI驅(qū)動的圖像分析算法，自動量化球體形態(tài)、細胞分布及藥物響應(yīng)。